Gene Wilder gab 1967 sein Spielfilmdebüt als hysterischer Unternehmer in Bonnie und Clyde, der von den titelgebenden Protagonisten entführt wird. Noch im selben Jahr folgte die erste Zusammenarbeit mit Mel Brooks, Frühling für Hitler, für die er sogar für einen Oscar als Bester Nebendarsteller nominiert wurde. Brooks und Wilder trafen sich während Wilders eher weniger glücklichen Tagen am Theater, da Mel Brooks zu dem Zeitpunkt bereits der Freund von Wilders Ko-Star Anne Bancroft war. Es folgten zwei weitere ikonische Filme des Teams Wilder und Brooks, Der Wilde Wilde Westen und Frankenstein Junior.
Bis zu den Dreharbeiten von Der Wilde Wilde Westen war Gene Wilder allerdings schon ein großer Star, nicht nur dank seiner Oscar-Nominierung, sondern weil er von Mel Stuart als Willy Wonka in Charlie und die Schokoladenfabrik besetzt wurde, eine Rolle, die ihn unsterblich gemacht hat. Der Film war zwar nicht schon bei der Veröffentlichung ein Hit, wurde über die Jahre aber zu einem absoluten Liebling der Kinder. Heute ist sein Willy Wonka als Meme fester Bestandteil der Internet-Kultur.
Ab Mitte der 70er unternahm Gene Wilder zunehmend Versuche, auch hinter der Kamera Fuß zu fassen, war als Autor und Regisseur allerdings nur mäßig erfolgreich. Eine seiner erfolgreicheren Arbeiten war 1984 Die Frau in Rot, in dem er auch selber mitspielte - an der Seite seiner damaligen Ehefrau Gilda Radner. Er und Radner wünschten sich Kinder, doch als sie 1986 schwanger wurde, diagnostizierten die Ärzte Eierstockkrebs, der nicht nur zu einer Fehlgeburt, sondern 1989 auch zu Gilda Radners Tod führte. Ihr Ableben machte Gene Wilder zu schaffen und war ein wichtiger Grund dafür, sich ein wenig aus dem Showgeschäft zurückzuziehen. Später sagte er in einem Interview, dass er das Geschäft schon immer gehasst habe. Es sei allein die Show, die er liebe.
1999 wurde festgestellt, dass Gene Wilder an einem Non-Hodgkin-Lymphom erkrankt war, er konnte allerdings dank Chemotherapie bis 2005 geheilt werden. Vor drei Jahren erkrankte er schließlich an Alzheimer. Er hinterlässt seine Frau Karen Boyer.